1.那些年我们爱过的PCR之PCR技术发展历程

 

遥想当年，我们还是懵懂少年，在学校里无忧无虑的做实验。那会儿刚开始接触到聚合酶链式反应（PCR），觉得这是一个神奇的实验平台，可以把含量极少的DNA片段扩增变成海量片段，从而轻而易举的检测出我们想要的目的基因片段。这个时候我们的状态大概是这样的：

然鹅，理想很丰满，现实很骨感，做了一段时间PCR实验后我们发现会出现很多不太令人满意的结果，比如这样：

大家可能会问，到底是哪里出了问题？为什么会没有预期的条带？说实话，这个问题真是不太好回答，因为导致PCR未扩增或者非特异扩增的因素很多，比如模板含有杂质、退火温度不合适、反应体系不够优化等等。由于PCR或者准确的说终点PCR只能在反应结束之后，通过凝胶电泳等方法对产物进行检测，不能反映整个PCR扩增的实时状态，因此很难判断问题到底出在哪。

这个时候，伟大的科学家们发明了荧光定量PCR（qPCR）检测技术，通过染料或者探针释放荧光，实时监控每一个PCR循环的荧光变化，最后生成扩增曲线，如果是染料法，最后还可以生成熔解曲线，分析产物的特异性。怎么样，是不是突然感觉柳暗花明又一村了。

然鹅，我们还是太年轻太天真，做了一段时间qPCR实验后我们发现检测灵敏度不够，没法做绝对定量等等，似乎困难重重。

不要捉急，曙光就在眼前，下面让我来为大家开启一扇新世界的大门，隆重欢迎PCR界的小鲜肉，数字PCR闪亮登场。

2.数字PCR横空出世之dPCR检测原理

数字PCR即Digital PCR（dPCR)是这几年才迅速发展起来的一种核酸定量分析技术，虽然出生的晚，但是潜力不小，因为数字PCR解决了qPCR这么多年悬而未决的问题，那就是不依赖于标准曲线的绝对定量并且可以将检测灵敏度提高至单个核酸分子。

那它是怎么做到的呢？这要从它的检测原理说起。数字PCR通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元（微滴），包含一个或多个拷贝的核酸分子(也就是说我们所说的 DNA 模板) ，这是与PCR或qPCR反应最大的区别，PCR或qPCR只在一个反应体系中进行，而数字PCR在每个反应单元（微滴）中都会对目标分子进行扩增，扩增结束后统计荧光信号并分析。

是不是听起来特别高(yi)大(lian)上(meng)？举个栗子，PCR或qPCR检测突变像是在大海里捞一个会发光的针，周围都是海水，很难看到针的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多个碗里面，瞧一眼很容易就知道哪个碗在发光了，而且，系统还会数出来到底有多少个碗里是发光的，多少个碗里是没发光的，这样一比，不就很容易的知道有多少数量的突变，就能做到绝对定量了。

举了半天栗子，手都酸了，可能很多人还是会说，道理我都懂，但是怎么做到的呢？

要知道，尽管dPCR的检测和分析原理很早就被提出来了，但是无奈受限于当时的技术条件，样本稀释与分配大多数都是靠手动操作完成的，受到很多因素的干扰和限制。最重要的是，结果分析对于研究者来说简直是噩梦，十分的枯燥和繁琐，他们的内心应该是拒绝的。

所以在很长一段时间内，dPCR的发展停滞不前，直到微流控技术与微纳集成制造工艺给dPCR过程中几个关键技术问题提供了解决方案。简单说来就是这两项技术的发展帮助dPCR研究与商业化平台发展突破瓶颈。

然后，正如我们看到的，全球多家生物医疗仪器公司在这个领域开展了激烈的竞争，也诞生了多个仪器设备，我们来看一下。

根据样品稀释分配方式不同，dPCR 技术可以分为三大类，一个是基于大规模集成微流控芯片（a），微反应室/孔板（b）和微滴式（c）。

目前市场上常见的2款dPCR仪器QuantStudio 3D 和QX200分别是基于微反应室（b）和微滴式（c）技术开发的，两者在检测参数上略微有些差异，请看下面的表格。

此外，两者各自都有一些优缺点，比如，QuantStudio 3D运行需要ThermoFisher配套的芯片，但试剂可以通用；QX200运行不需要芯片但是需要Bio-Rad配套试剂；QX200 需要多次移液操作，容易产生是微滴融合，QuantStudio 3D一次只能加载一张芯片，操作相对繁琐等。

3.dPCR不只是传说之数字PCR的应用

其实大家也不用太在意这么多可能连外星人都看不懂的检测原理和对比分析，俗话说得好，不看广告看疗效，是骡子是马还得拉出来遛遛（偷笑）。数字PCR检测其实离我们越来越近，下面我们以几个临床案例研究来举例，展示数字PCR巨大的临床应用前景（敲黑板）。

（1）.肿瘤个体化诊疗

通过检测T790M位点突变情况，可以更好地评估一代TKI药物的疗效及耐药情况并指导第三代TKI靶向药Osimertinib的使用。然而，由于qPCR平台ARMS检测技术的灵敏度有限，没有办法在含大量EGFR基因野生型背景核酸中高效准确的检测到T790M突变。

这个时候dPCR技术展现出了无与伦比的检测精度，此外，dPCR绝对定量的优势也能充分发挥出来了，可以监控突变含量变化，做到及早发现耐药[1]。

(2).基因表达分析

伊马替尼（Imatinib）可以有效帮助很多慢性髓细胞白血病（CML）患者延长生存期，但是临床上发现，伊马替尼的疗效与BCR-ABL1融合基因的转录产物表达量有很大的关系。

研究人员采用dPCR对CML患者的BCR-ABL1融合基因转录产物进行测定，结果检测下限可以达到0.001%，显示出dPCR在痕量核酸检测方面比qPCR具有无可比拟的优势[2]。

(3).无创产前检查

镰状细胞贫血（sickle cell anemia）是HBB基因突变引起的常染色体显性遗传病，有严重的危害，可以导致高达5%的胎儿死亡率及4.62%的孕妇死亡率。

而精准有效的无创产前诊断是预防镰状细胞贫血患儿出生的有效方法。研究人员采用dPCR技术检测孕妇胎儿游离DNA（cff-DNA）HBB基因突变。结果显示，dPCR技术能够确定87%的男性胎儿（n=45）和75%的女性胎儿（n=20）HBB基因的突变状态。

当cff-DNA浓度大于7%时，可以100%的检测出HBB基因突变[3]，可以说是相当厉害了。dPCR在其他很多领域，比如食品安全、环境微生物检测等也有着广泛的应用，由于篇幅有限，这里就不在赘述了。

最后再啰嗦一句，我们看到，随着dPCR的诞生，古老的PCR技术又焕发出新的活力，我们期待dPCR能够给精准医学的发展带来新的动力，解决更多临床和科研面临的难题，造福更多的人。

参考文献

1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.

2. Jennings LJ, George D, Czech J, et al.Detection and quantification of BCR-ABL1 fusion transcripts by droplet digital PCR.J Mol Diagn. 2014 Mar;16(2):174-9.

3. Barrett AN, McDonnell TC, Chan KC, Chitty LS. Digital PCR analysis of maternal plasma for noninvasive detection of sickle cell anemia. Clin Chem. 2012 Jun;58(6):1026-32.

注：文中漫画引用于Sketching Science @Facebook，部分数据引用于《数字PCR--原理、技术及应用》一书。