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数字PCR技术:一种灵敏,准确的核酸定量技术

2021-01-29 摘者:森美生物 浏览数:

 1999年,美国学者Kenneth Kinzler和BertVogelstein首次提出“数字PCR(digitalPCR,dPCR)”概念,该技术通过数数的方法,实现核酸分子的绝对定量。

 

图1.数字PCR发展

在介绍数字PCR之前,首先和大家回顾一下荧光定量PCR技术(real time PCR,qPCR),也就是COVID-19检测的金标准技术。荧光定量PCR在操作流程上包括:a.核酸分子提取;b.RNA逆转录;c.荧光定量PCR检测这三步骤。在检测原理上荧光定量PCR主要包括两种方法:a.染料法(SYBRGreen或Eva Green);b.Taqman探针法。

数字PCR(digital PCR,dPCR)
数字PCR技术,是一种荧光定量PCR技术的升级技术。依然是利用染料法或Taqman探针法进行的荧光检测,不同的是dPCR是终点检测荧光信号,qPCR是实时检测荧光信号。而数字PCR之所以是荧光定量的升级技术,主要是利用单分子扩增实现核酸的绝对定量。数字PCR将单个DNA分子置于独立的反应室中,并对其进行PCR扩增,利用TaqMan探针法或染料法检测特定的靶序列。因此,数字PCR检测主要包括三步:第一,通过特定技术将PCR反应混合液分散到几万个反应单元(反应室);第二,单分子在反应室中扩增;第三,PCR结束后检测荧光信号,最后通过泊松分布统计数数,计算出样本的拷贝数,实现核酸分子的绝对定量。与qPCR相比dPCR的绝对定量不需要利用标准曲线实现定量,而是直接可以通过单分子扩增结合泊松分布统计,既可实现绝对定量。

因此,数字PCR与荧光定量PCR不同点,主要体现在数字PCR需要进行分区后扩增,而荧光定量PCR是不需要分区扩增,而这种分区即可实现核酸分子的单分子扩增,单分子扩增既可以提高扩增效率,同时可以提高荧光检测的灵敏性和数据的可重复性。

 

图2.数字PCR操作流程

数字PCR分区方法
数字PCR的主要核心点在于将PCR反应液分区至数万微反应单元,实现单分子扩增。不同厂家利用不同方法实现核酸分子的分区,目前数字PCR分区方法主要包括3种:微流体数字PCR(Microfluidicdigital PCR,mdPCR)、微滴数字PCR(Dropletdigital PCR,ddPCR)和芯片数字PCR(Chipdigital PCR,cdPCR)。分别通过微流体通道、微液滴或微流体芯片实现分液,分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应,其中mdPCR基于微流控技术,对DNA模板进行分液,微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成,但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合,mdPCR已逐渐被其他方式取代;ddPCR技术,是相对成熟的数字PCR平台,利用油包水微滴生成技术,目前的仪器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系统和RainDance公司的RainDropTMdPCR系统,其中Bio-rad公司的dPCR系统利用油包水生成技术将含有核酸分子的反应体系生成20000个纳升级微滴,经PCR扩增后,微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测;cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上,目前的仪器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark™基因分析系统,Life Technologies公司的QuantStudio系统和JN Medsys公司的Clarity系统。利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体,通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增,实现绝对定量。

在这里我们以杭州纽蓝科技有限公司和JN medsys公司的芯片式数字PCR为例,带大家观看数字PCR如何实现核酸绝对定量。

 

 

dPCR与qPCR比较

实时荧光定量PCR可以进行绝对定量和相对定量,其中绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到目的基因的量,标准品可选择纯化的质粒DNA或体外合成的ssDNA等,其实qPCR的绝对定量是相对标准品的定量,并非完全地绝对定量;相对定量通过内参等进行换算起始样品中DNA的相对含量。数字PCR是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第3代PCR技术,它不需要标准品,也不要制作标准曲线,即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。同时,数字PCR是单分子扩增技术,能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加,反应受到抑制剂的影响就越小。

 

dPCR应用

数字PCR明显的优势,已经广泛应用于核酸检测的方方面面。肿瘤液态活检,遗传生殖检测,公共卫生检测,环境微生物检测,RNA表达检测,NGS文库定量,甲基化检测的等。后期将推出数字PCR具体的应用,欢迎大家持续关注。也希望大家了解数字PCR后,能够更好地解决目前难以解决的问题。

 

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